胰島素抵抗(IR)是在慢性非傳染性疾病（高血壓、冠心病、糖尿病）與增齡過(guò)程中廣泛存在的重要病理生理改變，表現(xiàn)為體內(nèi)循環(huán)中胰島素濃度不低于正常水平而其生物效應(yīng)低下的狀態(tài)。
由于以人為對(duì)象進(jìn)行胰島素敏感性(IS)的研究受到較大的限制。因此，通過(guò)改變實(shí)驗(yàn)條件誘發(fā)動(dòng)物IS改變，建立相應(yīng)的動(dòng)物模型已成為IS研究的重要方法。有證據(jù)表明攝食量與成分的變化可以導(dǎo)致機(jī)體血漿胰島素水平及IS的變化，如由于飲食原因引起單純性肥胖時(shí)出現(xiàn)的IR，以及熱量限制時(shí)出現(xiàn)的胰島素水平下降等。本研究選擇改變飼料攝入量與攝人成分的實(shí)驗(yàn)條件，模擬攝食習(xí)慣變化對(duì)代謝影響的狀態(tài)，建立了以不同飼料配方與喂飼方式誘導(dǎo)IS改變的大鼠模型。對(duì)于IR在體研究具有一定的應(yīng)用意義。
材料與方法
一、材料
1．實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：雄性SD大鼠132只，初始體重(198±14)g，購(gòu)自中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室。
2．動(dòng)物飼料：(1)正常基礎(chǔ)飼料：普通商用基礎(chǔ)塊料，購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所。(2)高脂高能量飼料：在參考文獻(xiàn)[5]基礎(chǔ)上調(diào)整配方，提高脂肪供熱量至59%，并相應(yīng)調(diào)整其他成分含量。由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所制備。兩種飼料成分及能量對(duì)比見(jiàn)表1。
二、實(shí)驗(yàn)方法
1．動(dòng)物分組與飼養(yǎng)：132只雄性SD大鼠分為三組，每組3個(gè)時(shí)間段，每個(gè)時(shí)間段用14只大鼠，7只用于鉗夾試驗(yàn)，7只用于OGTT和其他檢測(cè)，每組有2只機(jī)動(dòng)備用。各組大鼠均喂飼6個(gè)月，喂飼方式如下：(1)對(duì)照組：喂飼普通商用基礎(chǔ)塊料，自由攝食飲水；(2)肥胖組：喂飼高脂高能量塊料，自由攝食飲水,(3)限食組：為從喂飼高脂高能飼料至2個(gè)月時(shí)分出再喂飼普通商用基礎(chǔ)塊料，單籠(33cmX22 cmX13 cm)喂養(yǎng)，自由飲水，但限制食量為同齡大鼠每日進(jìn)食量的60%（約為16 g/d，40%的熱卡限制）。每日稱(chēng)量投放的飼料。大鼠每周稱(chēng)體重。三組大鼠在喂飼至2、4、6個(gè)月時(shí)采用正常血糖一高血漿胰島素鉗夾試驗(yàn)檢測(cè)IS并進(jìn)行口服糖耐量試驗(yàn)( oGrrT)，同時(shí)檢測(cè)大鼠體重、內(nèi)臟體脂重量及空腹血漿胰島素( FIns)水平。
2．正常血糖一高胰血漿島素鉗夾試驗(yàn)：鉗夾試驗(yàn)前一天下午大鼠用14%水合氯醛膠漿進(jìn)行腹腔內(nèi)注射麻醉(0.3 ml／l00g體重)。插管術(shù)后第二天上午進(jìn)行鉗夾實(shí)驗(yàn)，操作過(guò)程見(jiàn)參考文獻(xiàn)[6]，取最后五次葡萄糖輸注速率( GIR)的平均值作為反映大鼠IS的指標(biāo)。
3．OGTT:大鼠按2g葡萄糖/kg體重計(jì)算灌服相當(dāng)計(jì)量的50%葡萄糖水，分別在服糖前及服糖后15、30、60、120 min時(shí)從尾部取血測(cè)定血糖值。
4．大鼠血標(biāo)本采集測(cè)定及內(nèi)臟脂肪質(zhì)量測(cè)定：各組OGTT后48 h的大鼠斷頭處死，肝素抗凝取血，取上清貯存于-80℃冰箱。血漿胰島素采用放射免疫法測(cè)定。取左側(cè)附睪周?chē)娜恐荆Q(chēng)其濕重為內(nèi)臟脂肪質(zhì)量。
三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(r±s)表示，各項(xiàng)結(jié)果運(yùn)用SAS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析(ANOVA)。
結(jié) 果
一、不同飼料配方及喂飼方式對(duì)大鼠體重、內(nèi)臟脂肪質(zhì)量的影響
使用不同飼料及采取不同的方式喂飼后，大鼠的外部體態(tài)、體重、內(nèi)臟脂肪質(zhì)量等方面都有不同程度的變化（表2）。至實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)肥胖組大鼠體重顯著高于對(duì)照組；而限食組大鼠體重顯著低于其他各組。限食組大鼠體重與限食前相比減低了28.4%，與同齡對(duì)照組、肥胖組相比分別減低了47.9%和52.3%；
飼料
顆粒機(jī)、
秸稈顆粒機(jī)是養(yǎng)殖戶們生產(chǎn)顆粒飼料很好的選擇。
二、不同飼料配方及喂飼方式對(duì)大鼠IS的影響
在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，兩種飼料及兩種不同喂飼狀況大鼠的IS由高到低依次為：限食組>對(duì)照組>肥胖組（圖1）。對(duì)照組大鼠的IS喂飼4個(gè)月中無(wú)明顯變化，但至6個(gè)月時(shí)下降了52.3% (P<0.01)。肥胖組大鼠2個(gè)月時(shí)就已出現(xiàn)IS明顯下降，并隨喂飼時(shí)間延長(zhǎng)而不斷下降，與同齡對(duì)照組大鼠相比，2個(gè)月、4個(gè)月、6個(gè)月時(shí)分別低了55.O%、59. 5%、58.0% (P<0.01)。與同齡對(duì)照組及肥胖組大鼠相比，限食組大鼠IS始終維持在高敏狀態(tài)(P<0. 01)，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)限食組大鼠IS是肥胖組大鼠的10倍以上。
三、不同飼料配方及喂飼方式對(duì)大鼠OGTT結(jié)果的影響
不同飼料及喂飼狀態(tài)的大鼠出現(xiàn)不同的OG-TT結(jié)果（圖2）。對(duì)照組大鼠喂飼2個(gè)月、4個(gè)月時(shí)OGTT結(jié)果正常，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)超出正常值范圍，表現(xiàn)為糖耐量受損肥胖組大鼠喂飼2個(gè)月時(shí)服葡萄糖2h后血糖值(2 hPG)已表現(xiàn)為糖耐量受損，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)糖耐量受損程度進(jìn)一步加重。限食組大鼠OGTT始終維持在正常狀態(tài)，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)空腹血糖水平(FPG)和2 hPG在各組中最低。
四、不同飼料配方及喂飼方式下大鼠Flns水平
在6個(gè)月的喂養(yǎng)過(guò)程中，各組大鼠FIns變化見(jiàn)表3。對(duì)照組與肥胖組大鼠FIns在喂飼過(guò)程中均有增長(zhǎng)趨勢(shì)；肥胖組大鼠FIns的增長(zhǎng)趨勢(shì)較同齡對(duì)照組大鼠水平為高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。喂飼過(guò)程中，限食組大鼠Flns顯著低子其他兩組大鼠(P<0.05)。
五、不同飼料配方及喂飼方式模型的成功率
以高血漿胰島素一正常血糖鉗夾試驗(yàn)測(cè)定IS的結(jié)果與預(yù)期結(jié)果的吻合率判定本模型制備的成功率。本實(shí)驗(yàn)中共58只大鼠實(shí)施了鉗夾測(cè)定，獲得了53只大鼠的實(shí)測(cè)結(jié)果(鉗夾實(shí)驗(yàn)成功率91.4%)，其中僅有2只的鉗夾測(cè)定結(jié)果與該組大鼠試驗(yàn)預(yù)期結(jié)果方向不一致，模型的成功率達(dá)到96.2%。
討 論
飼料質(zhì)量和數(shù)量與機(jī)體代謝狀態(tài)密切相關(guān)，從而影響機(jī)體的IS及血漿胰島素水平，其中飼料質(zhì)量的影響尤為重要。本研究中使用的高脂高能飼料參考了已發(fā)表的配方，在不改變?cè)浞降鞍缀坎⒛芗庸こ晒腆w飼料的原則下，加大了脂肪比例。與普通商用飼料相比，能量高出40.5%；其中57. 9%的熱量由脂肪提供，脂肪提供總能量比普通商用飼料的12. 8%提高了3倍。這是導(dǎo)致食用這種飼料大鼠迅速出現(xiàn)體重增加，體脂堆積，IS下降和糖耐量受損的主要原因。以普通商用飼料不加限制的自由進(jìn)食方式喂養(yǎng)的對(duì)照組大鼠，隨喂飼時(shí)間延長(zhǎng)，在大鼠基本完成生長(zhǎng)發(fā)育之后，也出現(xiàn)了體內(nèi)脂肪堆積和IS下降，提示在飲食充足、無(wú)控制狀態(tài)的進(jìn)食情況下，大鼠也會(huì)隨著時(shí)間推移出現(xiàn)體脂積累，肥胖狀態(tài)發(fā)展，并由此造成IS下降等代謝紊亂現(xiàn)象。這點(diǎn)與人的通常情況相似。
高脂高能量飼料喂飼2個(gè)月后用自身對(duì)照的方式對(duì)這組中的部分大鼠用普通商用飼料進(jìn)行限食，每只每天食量攝入限定為對(duì)照組大鼠攝食量的60%左右。限食大鼠一般狀態(tài)良好，體重明顯降低，體脂蓄積明顯減少，IS大幅度升高，對(duì)糖負(fù)荷保持了良好的應(yīng)對(duì)狀態(tài)。提示適量的減低能量攝入，不僅能維持機(jī)體對(duì)胰島素的良好敏感狀態(tài)，還可以逆轉(zhuǎn)高脂高能量飼料造成的IR，恢復(fù)機(jī)體對(duì)糖負(fù)荷的一定承受能力，這與限食可以維持良好生理機(jī)能，減低疾病發(fā)生的報(bào)道相一致。
既往的報(bào)道多為高脂飼料喂養(yǎng)或直接靜脈輸入脂肪類(lèi)物質(zhì)誘導(dǎo)的IR動(dòng)物模型。本研究中使用的2種飼料配方及2種喂飼方法，快速經(jīng)濟(jì)易行，成模率高(>90%)，經(jīng)胰島素鉗夾試驗(yàn)證實(shí)可以成功地制備出穩(wěn)定、可靠的不同IS的大鼠模型。用此模型模擬IS變化的自然過(guò)程、研究IS不同狀態(tài)（降低和升高）的機(jī)制和IR的干預(yù)措施是完全可行的。目前ATⅡ水平的升高，其中以心肌局部ATⅡ升高更為明顯。心肌ATⅡ不僅可由ACE途徑生成，還可由糜蛋白酶途徑生成。糜蛋白酶是一種糜蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶，倉(cāng)鼠、狗和人體內(nèi)的糜蛋白酶屬于a-糜蛋白酶，可裂解ATI分子中的Phe8-His9肽鍵而生成ATⅡ，多項(xiàng)體內(nèi)和體外研究均證實(shí)，糜蛋白酶在冠狀動(dòng)脈粥樣硬化、心室肥厚、心肌纖維化的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，糖尿病倉(cāng)鼠心肌局部糜蛋白酶mRNA表達(dá)顯著升高，而ACE mRNA表達(dá)無(wú)顯著變化，提示心肌局部升高的ATⅡ可能來(lái)源于糜蛋白酶途徑。與本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果相似，Shiota等發(fā)現(xiàn)，兩腎一夾(2KIC)倉(cāng)鼠心肌纖維化的發(fā)生是糜蛋白酶活化的結(jié)果，而與ACE無(wú)關(guān)。
研究還發(fā)現(xiàn)，糜蛋白酶還可通過(guò)促進(jìn)心肌局部炎癥反應(yīng)的發(fā)生和心肌局部基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs) c10]的活化而加重心肌纖維化的發(fā)生和心肌病變的進(jìn)程，這可能也是糜蛋白酶參與糖尿病心肌病變發(fā)生的機(jī)制之一。
總之，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)腹腔注射STZ成功誘導(dǎo)了糖尿病心肌病變倉(cāng)鼠動(dòng)物模型，并發(fā)現(xiàn)糖尿病心肌病變時(shí)伴有心肌局部ATⅡ水平的增高和糜蛋白酶基因表達(dá)的增強(qiáng)，提示糜蛋白酶可能參與糖尿病心肌病變的發(fā)生和發(fā)展，抑制糜蛋白酶的表達(dá)或活性可能具有治療作用。
